AKTOR: TOBEY MAGUIRE
Główny bohater filmu. W dzieciństwie został sierotą, mieszka obecnie z ciocią May i wujkiem Benem w Queens w Nowym Yorku. Jest bardzo uzdolnionym studentem, pracuje w szkolnej gazetce, jedynym jego przyjacielem jest Harry Osborn. Peter od wielu lat podkochuje się w swojej pięknej sąsiadce Mary Jane Watson, jednak wrodzona nieśmiałość nie pozwala mu zamienić z nią ani jednego słowa. W czasie szkolnej wycieczki po laboratorium, w którym prowadzi się badania genetyczne nad pająkami, Peter zostaje ugryziony przez jeden z wyhodowanych genetycznie okazów. Dzięki temu wypadkowi zdobywa niesamowite umiejętności. Początkowo wykorzystuje je dla własnych korzyści, jednak po tragedii, jaka go spotyka, postanawia wykorzystać swoje moce dla dobra ludzkości i walki z przestępczością jako zamaskowany superbohater Nowego Yorku, zwany Spider-Man.
Spider-Man to alter ego Petera Parkera. Spider-Man jest obrońcą i bohaterem Nowego Yorku. Dysponuje niesamowitymi zdolnościami, które uzyskał na skutek ugryzienia przez zmodyfikowanego genetycznie pająka (powstałego w wyniku połączenia trzech najlepiej rozwiniętych gatunków tych stworzeń). Jest silny, zręczny i szybki, posiada swoisty, pajęczy „szósty zmysł”, potrafi również wytwarzać pajęczynę, którą wypuszcza z nadgarstków. Spider-Man skutecznie rozprawia się z pospolitymi przestępcami, ale wkrótce spotyka godnego siebie przeciwnika – obłąkanego Zielonego Goblina.
MARY JANE WATSON
AKTORKA: KIRSTEN DUNST
Sąsiadka Petera Parkera i miłość jego życia. Mary Jane Watson jest bardzo popularna w klasie i szkole w przeciwieństwie do nieśmiałego sąsiada. Wbrew pozorom nie jest osobą szczęśliwą, jej rodzice nieustannie się kłócą, gdyż ojciec nadużywa alkoholu. Mary Jane zaręczona jest z Flashem Thompsonem, jednak po maturze zrywa z nim. Próbuje rozpocząć karierę aktorki, ale odrzucona na castingu zmuszona jest podjąć pracę kelnerki, co jest dla niej powodem do wstydu. Później zostaje dziewczyną Harry’ego Osborna, ale dramatyczne wydarzenia, w których uczestniczy, powodują, że znajduje nową miłość – Petera Parkera/Spider-Mana.
HARRY OSBORN
AKTOR: JAMES FRANCO
Jedyny przyjaciel Petera Parkera, syn bogatego biznesmena Normana Osborna. Zamożność ojca nie przysparza mu popularności w szkole. Harry Osborn również podkochuje się w Mary Jane Watson, zamierza nawet jej się oświadczyć, ale przez zachowanie Normana Osborna w czasie Święta Dziękczynienia, do zaręczyn nie dochodzi. Harry, choć jest spadkobiercą ogromnej fortuny, nie jest szczęśliwy, a to z powodu surowości i oziębłości ojca. Po jego śmierci, za którą obwinia Spider-Mana, przysięga dozgonną zemstę na zamaskowanym superbohaterze.
NORMAN OSBORN/GREEN GOBLIN
AKTOR: WILLEM DAFOE
Szanowany biznesmen, ojciec Harry’ego, właściciel Oscorp – korporacji przemysłowej zajmującej się m.in. prowadzeniem badań nad produkcją i ulepszaniem uzbrojenia dla wojska USA. Od czasu odejścia żony Norman Osborn stał się oziębły, surowy i wyrachowany. Interesują go tylko zyski, nie poświęca czasu swojemu synowi i pomniejsza jego wartość w oczach Petera. Przemysłowiec, dowiedziawszy się, że armia zamierza wkrótce uciąć mu fundusze, postanawia na sobie przetestować najnowszy środek chemiczny tzw. wzmacniacz ludzkich możliwości. Eksperyment okazuje się tragiczny w skutkach, a Osborn staje się Zielonym Goblinem – wrogiem Spider-Mana i postrachem Nowego Yorku.
Zielony Goblin to alter ego Normana Osborna, jego druga „zła” osobowość. Goblin doprowadza Osborna do obłędu (w wyniku omamów słuchowych i wzrokowych), czyniąc z niego bezwzględnego szaleńca i mordercę. Ofiarą jego agresji padają członkowie zarządu Oscorp, po tym jak podejmują decyzję o sprzedaniu jego firmy. Green Goblin to potężny przeciwnik Spider-Mana. Ochrania go zbudowany z bardzo wytrzymałego materiału pancerz, którego maska przypomina twarz goblina, a do dyspozycji ma silnie uzbrojony szybowiec.
JOHN JONAH JAMESON
AKTOR: J.K. SIMMONS
Redaktor naczelny nowojorskiej gazety „Daily Bugle”, cieszącej się ogromną popularnością wśród mieszkańców miasta. Od czasu pojawienia się Spider-Mana nakład gazety znacznie wzrósł, co bardzo cieszy Jamesona. Jednak z niewiadomych względów nie cierpi on głównego bohatera. Chętnie jednak przyjmuje jego zdjęcia, które dostarcza mu pracujący jako wolny strzelec Peter Parker.
CIOCIA MAY PARKER
AKTORKA: ROSEMARY HARRIS
Wychowawczyni Petera, żona Bena Parkera. Po śmierci męża przeżywa ciężkie chwile, wierzy jednak w wyjątkowość bratanka, tak jak wierzył w niego wujek Ben. Jej bliskie relacje z Peterem wystawiają ją na atak Zielonego Goblina, co kończy się dla niej pobytem w szpitalu z powodu doznanego szoku, z którego na szczęście szybko wychodzi.
WUJEK BEN PARKER
AKTOR: CLIFF ROBERTSON
Mąż May Parker, wychowawca Petera, dla którego jest jak rodzony ojciec. Wujek Ben ciężko pracuje na utrzymanie rodziny, a gdy po 35 latach traci pracę elektryka niepokoi się o przyszłość bliskich. Bardzo wierzy w swojego bratanka, gdyż uważa, że chłopak stworzony jest do wielkich czynów. To właśnie słowa wujka Bena – „wielka siła to wielka odpowiedzialność” – zmieniają nastawienie Petera, który po jego śmierci z rąk złodzieja, rozpoczyna krucjatę przeciw złu jako Spider-Man.
