AKTOR: TOBEY MAGUIRE
Peter Parker jest obecnie studentem fizyki na Columbia University w Nowym Yorku. Wyprowadził się od cioci May i wynajmuje malutką kawalerkę u emigranta z Europy Wschodniej. Notorycznie traci stałe zatrudnienie. Jego ostatnią posadą była praca roznosiciela pizzy. Ciągle dostarcza gazecie „Daily Bugle” zdjęcia Spider-Mana, dzięki którym zarabia pieniądze potrzebne na utrzymanie mieszkania. Peter nie czuje się ostatnio szczęśliwy. Kontakty z jego bliskimi są bardzo napięte: Harry Osborn zaczyna nienawidzić go za to, że jest lojalny w stosunku do Spider-Mana, Mary Jane ma dość jego niezdecydowania i zaniedbywania na każdym kroku ich znajomości, natomiast ciocia May ma żal do niego, że nie powiedział całej prawdy o okolicznościach śmierci jej męża.
Druga tożsamość Petera Parkera, Spider-Man stała się symbolem Nowego Yorku. Spider-Man traktowany jest jak prawdziwy bohater i mimo niepochlebnych artykułów publikowanych o nim w gazecie „Daily Bugle” większość mieszkańców uważa go za pozytywną postać. Bohater przeżywa jednak kryzys tożsamości. Pragnie stabilnego życia zwykłego człowieka i poprawienia swoich relacji ze bliskimi. Z tego powodu Spider-Man zaczyna tracić swoje pajęcze moce. Zostaje postawiony przed trudnym wyborem: albo zrezygnuje z bycia superbohaterem albo jego życie prywatne przestanie istnieć. Pierwsza opcja wydaje się być bardziej kusząca, ale do wielkich wyrzeczeń skłoni Spider-Mana pojawienie się na horyzoncie Doktora Octopusa, szanowanego przez Petera naukowca, który przeobraża się w szalonego super-złoczyńcę.
MARY JANE WATSON
AKTORKA: KIRSTEN DUNST
Mary Jane jest obecnie popularną aktorką grającą w przedstawieniach teatralnych. Pracuje również jako modelka w kampaniach reklamowych kosmetyków. Do pełni szczęścia brakuje jej tylko kochającego i stałego partnera. Mary Jane pragnie skrycie by był nim Peter Parker, ale widząc obojętność dawnego sąsiada rezygnuje z tych marzeń. Poznaje przystojnego astronautę, Johna Jamesona, za którego zamierza wyjść za mąż. Porwanie przez Doktora Octopusa i odkrycie prawdziwej tożsamości Spider-Mana zmusi jednak Mary Jane do podjęcia życiowej decyzji. Okaże się, że jej miłość do Petera Parkera nie ma granic, a ona jest gotowa, by dzielić z nim zarówno radości, jak i trudy jego podwójnego życia.
HARRY OSBORN
AKTOR: JAMES FRANCO
Harry Osborn jest bogatym biznesmenem i spadkobiercą majątku ojca. Zarządza jako nowy właściciel wiodącym koncernem przemysłowym – Oscorp. Nie mogąc zapomnieć o przysiędze złożonej po śmierci ojca, ciągle próbuje ukarać Spider-Mana za wyrządzoną mu krzywdę. Harry liczy na ogromne zyski, które ma zapewnić eksperyment przeprowadzony przez doktora Otto Octaviusa, światowej sławy naukowca sponsorowanego przez Oscorp. Niestety eksperyment okazuje się tragiczny w skutkach. Harry ponosi wielkie straty finansowe, a pocieszenia szuka w piciu alkoholu. Zaczyna darzyć coraz większą pogardą Petera, ponieważ nienawidzi jego lojalności w stosunku do Spider-Mana. Chęć ukarania superbohatera za wszelką cenę prowadzi go do zawarcia umowy z szalonym Doktorem Octopusem. Po odkryciu tożsamości Spider-Mana, Harry jest w szoku – zaczyna mieć omamy wzrokowe i widząc ducha ojca znajduje tajny schowek Normana Osborna, gdzie poznaje przerażającą prawdę o przeszłości nieżyjącego rodzica.
OTTO OCTAVIUS/DOCTOR OCTOPUS
AKTOR: ALFRED MOLINA
Otto Octavius to ceniony na świecie naukowiec pracujący nad badaniem fuzji jądrowej. Jej stałe podtrzymywanie stałoby się błogosławieństwem dla ludzkości – na Ziemi istniałoby „małe słońce” będące źródłem niewyczerpalnej energii. Dzięki funduszom z Oscorpu, Otto przeprowadza eksperyment, który kończy się jednak tragicznie. Jego ukochana żona, Rosie ginie, a on sam traci przytomność i ledwie żywy trafia do szpitala. Octavius zatraca się w szaleństwie i przyjmuje nową tożsamość – Doktora Octopusa.
Doktor Octopus to szaleniec budzący postrach wśród mieszkańców Nowego Yorku. Wyposażony jest w cztery mechaniczne ramiona podłączone do jego układu nerwowego. Zniszczenie nerwowego chipa blokującego powoduje, że sztuczna inteligencja zarządzająca ramionami ma coraz większy wpływ na poczynania Octaviusa, namawiając go do popełniania zbrodni. Jako cel uświęcający środki Octopus widzi rozwój nauki. Zawiera potajemną umowę z Harrym Osbornem. W zamian za dostarczenie Spider-Mana ma otrzymać tryt potrzebny do podtrzymania fuzji jądrowej. Jest gotów poświęcić wszystko dla pomyślnego przebiegu tego eksperymentu.
JOHN JONAH JAMESON
AKTOR: J.K. SIMMONS
Jonah Jameson jest redaktorem naczelnym gazety „Daily Bugle” publikującej artykuły i zdjęcia Spider-Mana. Za fotki superbohatera płaci Peterowi Parkerowi pieniądze, które ledwie starczają na utrzymanie mieszkania przez studenta. Jameson nadal traktuje Spider-Mana jako zagrożenie dla mieszkańców Nowego Yorku. Po zdobyciu kostiumu superbohatera zmienia o nim zdanie. Wie, że tylko Spider-Man może powstrzymać szalonego Doktora Octopusa i uratować narzeczoną jego syna. Taka pozytywna opinia nie trwa jednak długo. Zabranie kostiumu z redakcji przez Spider-Mana doprowadza Jamesona do szału, który ponownie określa superbohatera wyrażeniami: kryminalista, przestępca, złodziej i zagrożenie.
CIOCIA MAY PARKER
AKTORKA: ROSEMARY HARRIS
May Parker, ciocia Petera, przeżywa ciężkie chwile. Boryka się z problemami finansowymi. Trudna sytuacja materialna zmusza ją do przeprowadzki. Ma też za złe bratankowi ukrywanie prawdy o śmierci Bena. Wybacza mu jednak kłamstwo. Nieoczekiwanie staje się zakładnikiem Doktora Octopusa. Po uratowaniu przez Spider-Mana zmienia o superbohaterze zdanie. Wie, że jest dobrym człowiekiem. To właśnie ciocia May rozbudza w przeżywającym kryzys Peterze chęć powrotu do roli Spider-Mana. Jej słowa o bohaterze dającym ludziom nadzieję sprawiają, że Parker postanawia jeszcze raz stawić czoła Doktorowi Octopusowi.
JOHN JAMESON
AKTOR: DANIEL GILLIES
Syn Jonaha Jamesona, sławny astronauta i narodowy bohater, o którym mówi się, że jako pierwszy grał w piłkę na Księżycu. John zamierza poślubić Mary Jane Watson. Tuż przed uroczystością dziewczyna z miłości do Petera Parkera rezygnuje z małżeństwa, pozostawiając przed ołtarzem zaskoczonego Johna.
.
.